Estabelecimento e caracterização de células tumorais de pacientes portadores da síndrome de Li-Fraumeni / Establishment and characterization of cancer cells from patients with Li-Fraumeni syndrome

A Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) é uma síndrome rara de predisposição hereditária ao câncer relacionada a mutações germinativas no gene TP53. Portadores de mutações neste gene apresentam alto risco para o desenvolvimento de um amplo espectro tumoral em idade precoce. No sul do Brasil, 0,3% da população local é portadora de uma mutação germinativa no códon 337 do gene TP53 (p.R337H) que foi descrita como tendo um efeito fundador no país. Sabe-se que a proteína p53 desempenha um papel crítico na regulação da diferenciação e do padrão de divisão das células tronco (CT). As CT são células capazes de se autorrenovarem e de se diferenciarem em diversos tipos celulares. Estas células têm sido apontadas como responsáveis pela iniciação e progressão tumoral, sendo resistentes aos tratamentos quimioterápicos. Levantou-se a hipótese de que pacientes LFS possuem alto risco para o desenvolvimento de tumores malignos devido a presença de CT em tecidos específicos. O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar células tronco tumorais (CTT) de pacientes LFS portadores de mutações germinativas no gene TP53. As amostras tumorais foram obtidas mediante consentimento informado e no total, 12 culturas de células primárias de 11 pacientes LFS com e sem a mutação p.R337H foram estabelecidas. Uma cultura de células oriunda de um carcinoma de mama foi o enfoque do presente estudo. O novo protocolo nomeado "ALTERNADO" (cultura em monocamada ­ cultura em suspensão (mamoesferas) ­ cultura em monocamada) foi elaborado e permitiu o cultivo prolongado das células obtidas sem sinais de senescência. Os métodos de imunofluorescência e citometria de fluxo demonstraram que estas células apresentam o mesmo perfil imunofenotípico CD44high/+, CD24low/- e ALDH+ previamente descrito para CTT de mama. Ainda, observamos a expressão dos seguintes marcadores: nanog, sox2, oct3/4, p53 e Ki67. A videomicroscopia por time-lapse permitiu a observação de divisões simétricas frequentes e ausência de fenótipos senescentes na cultura obtida. A análise do padrão de divisão celular utilizando o anti-oct3/4 demonstrou que ambos os tipos de divisões (simétrica e assimétrica) ocorrem, porém a divisão simétrica se mostrou mais frequente. Além disso, as células apresentaram capacidade de diferenciação in vitro para as linhagens adipogênica e osteogênica, bem como alta capacidade clonogênica. O perfil da expressão dos receptores de estrógeno e progesterona, além da capacidade proliferativa demonstrada pelo anti-Ki67 se mostrou idêntica ao observado no anatomopatológico do tumor, porém, diferentemente do tumor, algumas células tiveram marcação citoplasmática para o receptor HER2. A análise de expressão gênica em larga escala revelou perfil diferencial de expressão entre as mamoesferas e as células aderentes, sendo que os principais genes diferencialmente expressos na mamoesfera estavam relacionados com o aumento da capacidade de metástase e invasão. Por meio do ensaio de invasão demonstramos que as mamoesferas possuem células com maior capacidade de invasão quando comparadas as mesmas células cultivadas em monocamada. Estabelecemos, pela primeira vez, um banco de células a partir de diferentes tipos tumorais de pacientes LFS. As culturas celulares primárias estabelecidas e os dados apresentados no presente trabalho são de extrema importância para o melhor entendimento do papel desta mutação específica e também do gene TP53 na biologia dos tumores desta coorte de pacientes

Li-Fraumeni Syndrome (LFS) is a rare syndrome of hereditary predisposition to cancer which is related to germline mutations in TP53 gene. Carriers of mutations in this gene are at high risk for the development of a broad spectrum of tumors in early ages. In southern Brazil, 0,3% of the local population is carrier of a germline mutation in codon 337 of TP53 gene (p.R337H) which was described as having a founder effect in the country. It is known that p53 plays a critical role in the regulation of differentiation and the pattern of stem cells (SC) division. SC are cells capable of self renewing and differentiating to different cell types. These cells have been identified as responsible for tumor initiation and progression, being resistant to chemotherapy treatments. It was hypothesized that LFS patients are at high risk for developing malignant tumors due to the presence of SC in specific tissues. The objective of the present study was to isolate and characterize tumor stem cells (CSC) of LFS patients carriers of germline mutations in TP53 gene. Tumor samples were obtained with informed consent and in total, 12 primary cultures from 11 patients with and without LFS p.R337H mutation were established. A culture of cells derived from a breast carcinoma was the focus of the present study. The new protocol named "ALTERNATE" (monolayer culture - suspension culture (mammospheres) - monolayer culture) was prepared and allowed extended cultivation of obtained cells without signs of senescence. Immunofluorescence and flow cytometry assays demonstrated that these cells shared the same immunophenotypic profile CD44high/+, CD24low/- and ALDH+ previously described for breast CSC. We also observed the expression of the following markers: nanog, sox2, oct3/4, p53 and ki67. The videomicroscopy by time-lapse allowed the observation of frequent symmetric divisions and the lack of senescent phenotypes in established culture. The cell division pattern analysis by using anti-oct3/4 showed that both types of divisions (symmetric and asymmetric) occur, but symmetric division was more frequently observed. Moreover, the cells had the ability to differentiate in vitro to osteogenic and adipogenic lineages, as well as possess high clonogenic capacity. The expression profile of estrogen and progesterone receptors, as well as proliferative capacity demonstrated by anti-ki67 showed identical pattern to that observed in the tumor, however, some cells began to express HER2 receptor in cytoplasm. The microarray analysis revealed distinct gene expression profile between mammospheres and adherent cells, while the major differentially expressed genes in mammospheres were associated with increased metastasis and invasion ability. Through the invasion assay we demonstrated that our cells cultured as mammospheres possess high invasive capacity when compared to the same population of cells but which were cultured in monolayer. Herein, we established for the first time a bank of cells from different tumor types of LFS patients. These obtained cell cultures and the results presented in this study are extremely important to better understand the role of this specific mutation and also the TP53 gene in tumor biology of this cohort of patients

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